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YF?555 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit（橙红色荧光）
产品概述：
产品内容
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组分 |
20T |
50T |
|
A. TUNEL Equilibration Buffer |
2×1mL |
5mL |
|
B. YF555 TUNEL ReactionBuffer |
2×0.5mL |
5×0.5mL |
|
C. TdT Enzyme |
20 μL |
50 μL |
|
D. Proteinase K (2 mg/mL) |
40 μL |
100 μL |
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E. DNase I (2 U/μL) |
5 μL |
13 μL |
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F. 10 × DNase I Buffer |
100 μL |
260 μL |
储存条件
本产品应置于-20℃储存； TUNEL Reaction Buffer 避光储存于-20℃，避免反复冻融。有效期见外包装。
产品先容
细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp 的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱，本试剂盒采用 TUNEL 法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡细胞断裂 DNA 的 3?-OH 末 端 催 化 掺 入 YF555-dUTP 。
YF555-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。 TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞， 而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA链断裂的细胞。TUNEL 实验中， TdT 酶催化 dUTP 掺入断裂的 DNA 链的 3’羟基末端。抗原标记的 dUTP（如digoxin-dUTP、生物素-记的 dUTP，因为它可以直接进行原位检测，是一种更快速、直接的检测手段。
常见问题解答：
◆为什么出现了一些非特异标记？
1.有些细胞或组织，比如平滑肌，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致假阳性，出现非特异性的荧光标记。因此，取出细胞或组织后要马上固定并充分固定，以阻止这些酶的活性；
2.使用了不恰当的固定液，推荐使用4%多聚甲醛；
3.TUNEL反应时间过长，或者在反应中细胞或组织表面未能一直保持湿润。因此。要注意控制反应时间，并确保反应液能很好地覆盖样品 。
4.石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合，所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要彻底；
5.有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
◆为什么没有染上荧光？
1.固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液对组织的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率；
2.通透不充分。细胞与冰冻切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蜡切片推荐使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同，可以适当调整；
3.延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量；
4.确定实验对象细胞凋亡时有DNA断裂现象发生。
◆为什么假阳性过高？
1.阴性对照有染色，则说明是非特异性染色；
2.若阴性对照无染色，那么可能是由于固定不充分，组织内有内源性核酸酶的残留，使得DNA全部被切断呈现阳性染色。
◆如何对细胞核进行复染？
可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。
◆为什么荧光背景高？
1.支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证；
2.TUNEL反应过强：可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用 。
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