澳门游戏平台-正规手机网投平台

中文 ENGLISH

 “完美新发明”GelBlue——安全凝胶电泳新时代 

  • Minerva Super Fusion Cloning Kit(无缝克隆试剂盒)

    产品货号: M2026

    产品规格: 20T/50T

    目录价(元):600/1280

    可替代的同类产品

    大包装询价


产品概述:

产品内容

组分

20T

50T

Super Fusion Cloning Mix (2×)

   100 μL   

250 μL

Control Plasmid, linearized (50 ng/μL)

5 μL

5 μL

1000 bp Control Fragment (50 ng/μL)

5 μL

5 μL

注:微量体积试剂请在正式实验开始前进行瞬时离心操作

储存条件

-20℃保存,有效期见外包装。

产品先容
无缝克隆是一种简单、快速并且高效的 DNA 定向克隆技术,可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。Minerva Super Fusion Cloning Mix 通过识别 DNA 片段和线性化载体末端的 15-20 bp 同源序列,50℃反应 15-60min即可将 DNA 片段和线性化载体高效精确地融合在一起,完成定向克隆,且克隆阳性率可达 95%以上。

产品特点
1. 简单、快速、高效, 适用于几乎任何载体在任意位点进行定向克隆;
2. 不依赖于连接酶,无载体自连现象,阳性率可达 95%以上;
3. 可高效克隆 50 bp-10 kb DNA 片段;
4. 无需考虑插入片段自身携带的酶切位点;
5. 兼容 PCR 反应体系与几乎所有的酶切反应体系,克隆载体酶切产物或 PCR 产物和插入片段 PCR 产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆,最快可在15分钟内完成反应;
6.可一次连接多个插入片段。


说明书:


 UE-M2026

常见问题解答:


转化效率低
1.感受态效率低下:使用新制备或妥善保存的感受态细胞。
2.DNA片段比率不佳:按照说明书推荐的最适用量和比率配制反应体系。常用的吸光测量法易受DNA纯度、缓冲液pH值等因素影响,测定偏差较大,因此推荐使用琼脂糖电泳测定样品浓度。
3.DNA片段纯度不够:对载体和插入片段进行胶回收纯化。由于EDTA等金属离子螯合剂会抑制无缝克隆反应,因此纯化产物应溶解于ddH2O中,切勿使用Tris-EDTA等缓冲液。
4.反应产物过量:在转化体系中,无缝克隆反应产物体积不应超过感受态细胞体积的1/10。

大量克隆不含插入片段
1.载体线性化不完全:载体线性化反应时,提高限制性内切酶使用量,延长反应时间,或使用胶回收纯化酶切产物。
2.相同抗性质粒污染:以质粒为模板进行插入片段PCR扩增时,使用预线性化质粒作为扩增模板,使用DpnI等甲基化敏感性内切酶对扩增产物进行处理,或对产物进行胶回收纯化。
3.平板抗性不足:确保使用正确的抗生素,并使用新鲜制备的抗生素平板。

大量克隆含有不正确插入片段
1.非特异性PCR扩增产物:优化PCR体系,提高特异性,或胶回收纯化PCR产物。
2.载体线性化不完全: 载体线性化反应时,提高限制性内切酶使用量,延长反应时间,或胶回收纯化酶切产物。

引物设计原则有哪些?
1.与目的片段特异性结合的碱基序列(18-25 bp);
2.酶切位点(可选);
3.同源臂(15-25 bp,GC含量40%-60%)。

载体的线性化方式?
双酶切、单酶切和反向PCR,优先选择双酶切。

平板上长不出克隆或者克隆数很少
1.引物设计不正确:引物包含15-25 bp同源臂(不计算酶切位点),GC含量40%-60%;若同源臂的GC含量过高或过低,可重新选择插入位点;
2.线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量,即比例不佳:尽量按照说明书推荐的量和比例配置重组体系;
3.重组体系不低于10 μl,各组分添加不低于1μl(避免低体积添加造成量取不准);若载体或片段浓度过低导致添加量超过20 μl,可同比例降低载体和片段的添加量;插入片段长于载体时,重组体系中片段与载体的摩尔比为2:1;
4.载体和插入片段不纯,抑制反应:未纯化DNA不应超过4 μl(反应体系体积的1/5);建议线性化载体和PCR产物进行胶回收纯化,纯化产物溶解在pH 8.0的ddH2O保存;
5.感受态细胞的转化效率需大于107 cfu/μg,重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率;选择克隆用感受态细胞,不能选择表达用感受态细胞;
6.酶切获得的载体应经加热处理失活限制性内切酶,对于加热处理不能失活的酶切体系,必须经过胶回收纯化;
7.核查基因是否致死。

多数克隆含有不正确的插入片段
PCR产物混有非特异性产物:优化PCR体系,提高特异性;或者胶回收PCR产物;鉴定更多的克隆。

插入片段出现碱基突变
插入片段在PCR获得时使用高保真的聚合酶;若突变发生在同源臂区域,请进行引物序列核对。

多数克隆不含插入片段
1.克隆载体线性化不完全:可通过阴性对照检测载体是否线性化完全;对于优化酶切体系,提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物;
2.插入片段获得的PCR体系中混入了相同抗性的质粒:PCR扩增模板为环状质粒时,如扩增产物直接用于重组反应时需进行DpnI消化,或者进行胶回收纯化;
3.平板抗性不足:确保使用正确的抗生素,并使用新鲜配制的抗生素平板。

阳性对照不长斑或很少
感受态细胞效率低:确保转化效率>107cfu/μg,可进行简单检测,将1 ng质粒转化至100 μl感受态细胞中,取1/10进行涂板,生长1000个菌斑,估算感受态转化效率为107cfu/μg;重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率;感受态选择克隆感受态,不能用表达感受态。

菌液PCR无条带
1.引物不正确:建议使用载体的通用引物进行菌检,或至少使用一条通用引物;
2.PCR体系或程序不合适:没有目的条带也没有空质粒条带,建议优化PCR体系、程序;或者提取质粒,以质粒做模板PCR验证,或着进行酶切验证;
3.重组失败:只有空质粒的条带,说明重组不成功,载体线性化不完全,建议优化酶切体系。


引用及参考文献:


1.The R2R3-MYB Factor FhMYB5 FromFreesia hybrida Contributes to theRegulation of Anthocyanin andProanthocyanidin Biosynthesis
Yueqing Li, Xiaotong Shan, Liudi Zhou, Ruifang Gao, Song Yang, Shucai Wang, Li Wang,Xiang Gao
Frontiers in plant science(2019)
应用方向:载体构建(单片段):pUC19载体与FhMYB5连接

2.A functional homologue of Arabidopsis TTG1 from Freesia interacts with bHLH proteins to regulate anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis in both Freesia hybrida and Arabidopsis thaliana
Xiaotong Shan,Yueqing Li,Song Yang,Ruifang Gao,Liudi Zhou,Tingting Bao,Taotao Han,Shucai Wang,Xiang Gao,Li Wang
Plant Physiology and Biochemistry(Volume 141August 2019, Pages 60-72)
应用方向:载体构建(单片段):HA(人类流感血凝素)标记的FhTTG1与pUC19连接

3.Efficient isolation of protoplasts from freesia callus and its application in transient expression assays
Xiaotong Shan,Yueqing Li,Liudi Zhou,Linna Tong,Chao Wei,Lijun Qiu,Xiang Gao,Li Wang
Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)(September 2019, Volume 138, Issue 3, pp 529–541)
应用方向:载体构建(单片段):HA(人类流感血凝素)标记的FhTTG1与pUC19连接

4.Functional Differentiation of Duplicated Flavonoid 3-O-Glycosyltransferases in the Flavonol and Anthocyanin Biosynthesis of Freesia hybrida
Xiangyu Meng, Yueqing Li1, Tongtong Zhou, Wei Sun, Xiaotong Shan, Xiang Gao,Li Wang
Frontiers in Plant Science(18 October 2019)
应用方向:载体构建(单片段):FhPAP1或FhMYBF1与pUC19片段组装

5.Immune responses in mice and pigs after oral vaccination with rabies virus vectored Nipah disease vaccines
LeiShuai,JinyingGe,ZhiyuanWen,JinliangWang,XijunWang,ZhigaoBu
Veterinary Microbiology Volume 241, February 2020, 108549
应用方向:载体构建(单片段):NiV-G或NiV-F克隆到Pme I

6.MYB21 interacts with MYC2 to control the expression of terpene synthase genes in flowers of F. hybrida and A. thaliana
Zhongzhou Yang, Yueqing Li, Fengzhan Gao, Wei Jin, Shuying Li, Shadrack Kimani, Song Yang, Tingting Bao, Xiang Gao, Li Wang
Journal of Experimental Botany

7.UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis Kit; Minerva Super Fusion Cloning Kit; 2 x SYBR Green Mixture
Qiang Fang,Yueqing Li,Baofeng Liu,Xiangyu Meng,Zhongzhou Yang,Song Yang,Tingting Bao,Shadrack Kimani,Xiang Gao,Li Wang
Plant Physiology and Biochemistry(Volume 154, September 2020, Pages 439-450)

8.The spatio‐temporal biosynthesis of floral flavonols is controlled by differential phylogenetic MYB regulators in Freesia hybrida
Xiaotong Shan,Yueqing Li,Song Yang,Zhongzhou Yang,Meng Qiu,Ruifang Gao,Taotao Han,Xiangyu Meng,Zhengyi Xu,Li Wang,Xiang Gao
New phytologist

9.Functional Characterization of Terpene Synthases Accounting for the Volatilized-terpene Heterogeneity in Lathyrus odoratus Cultivar Flowers
Tingting Bao, Kimani Shadrack, Song Yang, Xinxin Xue, Shuying Li, Ning Wang, Qiuyue Wang, Li Wang, Xiang Gao, Quentin Cronk
Plant and Cell Physiology

返回顶部

更多>> 技术支撑

  • 地址:苏州市相城经济开发区观塘路1号 C座10F
  • 电话:1号技术18551299082、2号技术18551296769、3号技术18551290363
  • 电话:1号销售18551296519、2号销售13182673060、3号销售(工业)18551296656

在线
客服

在线客服服务时间:9:00-24:00

  • 1号技术支撑
    3186249013
  • 2号技术支撑
    3111274163
  • 3号技术支撑
    3106481410
  • 1号销售(渠道)
    3448192208
  • 2号销售(渠道)
    3613306134
  • 3号销售(工业)
    2738609142

客服
热线

客服热线
0512-69571710、18551296680

1号技术热线 185512990822号技术热线 185512967693号技术热线 185512903631号销售(渠道) 185512965192号销售(渠道) 131826730603号销售(工业) 18551296656

关注
微信

微信服务号
顶部

澳门游戏平台|正规手机网投平台

XML 地图 | Sitemap 地图